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BPIT展会预告丨Chemometec黑科技助力微载体培养细胞计数

BPIT展会预告丨Chemometec黑科技助力微载体培养细胞计数

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  • 发布时间:2021-05-23 11:01
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★ 注册人数超过1500丨BPIT 2021 生物药创新技术大会即将在上海开幕

★ 5年坚持发现创新药,千人盛会BPIT 2021逐步呈现生物医药产业结构升级之路

2021年3月31日/医麦客新闻 eMedClub News/--随着基因编辑技术和基因递送载体等技术的逐步提高与完善,在肿瘤治疗、罕见病等基因治疗主战场的巨大市场前提下,越来越多本土和跨国制药企业布局基因和细胞治疗行业。基因治疗和病毒疫苗为各种恶性疾病的治疗带来了新的希望。

病毒载体的生产通常使用静态培养皿和小体积不锈钢生物反应器。但是,每个容器的产量可能相对较低,并且经常需要同时操作多个容器。这极大地增加了劳动强度,生产成本,污染风险,并限制了其扩大规模的能力,因此,一旦基因治疗或病毒疫苗药物进入临床阶段或推向市场,就难以满足所需的数量。一次性生物反应器与微载体相结合,为病毒载体和疫苗的生产提供了很好的选择。

微载体培养技术早在1967年就被用于动物细胞大规模培养。经过半个世纪的发展,该技术已日趋完善和成熟,并广泛应用于疫苗、基因治疗等生物医药的生产中。应用微载体可在生物反应器中培养贴壁细胞(图1)。它们充当贴壁细胞的支架,细胞粘附于其表面,并随微载体悬浮于生物反应器内,兼具悬浮培养和贴壁培养的优点。提供了极大的培养表面积/体积比,提供了高的细胞产量而无需凭借大容量的设备,使得细胞在贴壁状态实现了悬浮培养。对于贴壁依赖性细胞培养而言,微载体培养需要相当少的空间,就可生产一定量的细胞或细胞产物,不仅减少了劳动力需求,又降低了污染风险。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞,如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞等,为疫苗、蛋白质等的生产提供了解决方案。

Figure 1. 微载体在生物反应器中的应用

但是微载体培养的细胞在关键的计数步骤同样面临严峻的挑战,利用传统计数方法会涉及到繁杂的细胞处理和人工操作:

传统微载体培养细胞计数方法(图2)及其缺点

· 过程复杂

· 胰酶消化细胞非常耗时

· 容易造成细胞损伤

· 细胞成团影响计数

· 对操作要求高

· 计数结果精确性低

Figure 2. 传统微载体培养细胞的计数流程

来自丹麦的 ChemoMetec,一直引领细胞计数的精准合规,其生产的NucleoCounter®系列细胞计数仪NC-200™、NC-250™和NC-3000™(图3),通过使用先进的细胞图像分析和荧光染色技术来测定细胞数量和活率,为细胞计数工艺的精准稳定及一致性提供保障。

Figure 3. NucleoCounter系列细胞计数仪

为了解决微载体培养细胞的计数困境,Chemometec开发了独特的、用于检测微载体培养细胞活率及数量的一站式解决方案,且无需提前消化。完美的规避了传统计数方法操作繁琐、耗时、结果精确性低等缺点。此外,仪器配套软件符合21 CFR part 11要求,适用于GMP生产。

NucleoCounter®系列细胞计数仪对微载体培养细胞计数和活率分析的方法

首先将微载体培养细胞样本分为两等份,而后向其中一份中按比例加入裂解液Solution A100以及中和液Solution B,轻轻混匀,使细胞从微载体上分离并裂解细胞膜,形成稳定的细胞核悬液。将此细胞核悬液上样至Via1 cassette中,细胞核经DAPI染色后发出蓝色荧光,经仪器荧光分析后,得出总细胞数(图4)。

Figure 4. NucleoCounter系列仪器对微载体培养细胞的计数及活率分析原理及结果展示

(A)将细胞从微载体上分离并裂解从而获得细胞核悬液 (B)被DAPI染色的细胞核荧光图像 (C)应用软件直观验证是否所有细胞都被计数

另一份样本不需要进行任何预处理,直接上样至Via1 cassette,由于死细胞会从微载体上脱落而游离于样本悬液中。因此Via1 cassette内含的DAPI染料可以对悬液中的死细胞进行染色。经NucleoCounter®细胞计数仪检测,可以得到死细胞数量。最终仪器通过对两次检测的结果进行运算,得出总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度以及细胞活率。整个检测过程耗时不超过2分钟,与传统方法相对比,NucleoCounter®细胞计数仪针对微载体培养细胞的计数方案由于避免了离心、移液以及孵育消化等步骤,因此消除了人为操作引入的结果误差,极大程度的提高了结果的精确性以及操作人员的效率。(图5)

Figure 5. NucleoCounter细胞计数仪针对微载体培养细胞的计数流程

NucleoCounter®细胞计数仪针对微载体培养细胞计数的应用

目前,NC-200细胞计数仪已被国内外众多生物医药企业应用于细胞和病毒生产过程中针对微载体培养细胞的计数过程。此外,众多微载体生产企业也将NC-200及其微载体细胞计数方案应用于工艺和产品开发中,如:GE Healthcare、Corning、及Pall (Danaher)等[1-3]。

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